雙抗夾心法制備Elisa試劑盒-怎么確定包被用抗體濃度?

　　ELISA所用的包被抗原一般是蛋白質(zhì)，促使蛋白質(zhì)同板基質(zhì)結(jié)合的力一般是疏水作用。不同的蛋白因其疏水性不同而有不同的結(jié)合常數(shù)。由于一般的蛋白其親水基團(tuán)都在ELISA的原理和類型

　　1. ELISA的原理

　　ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記.結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性.在測(cè)定時(shí),受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng).用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi).再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上.此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例.加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析.由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度.

　　2. ELISA的類型

　　ELISA可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體.在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑1)固相的抗菌素原或抗體,即"免疫吸附劑"(immunosorbent);(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體,稱為"結(jié)合物"(conjugate);(3)酶反應(yīng)的底物.根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件,可設(shè)計(jì)出各種不類型的檢測(cè)方法.用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型:

　　2.1 雙抗體夾心法測(cè)抗原

　　雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原常用的方法,操作步驟如下:

　　1) 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體.洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì).

　　2) 加受檢標(biāo)本,保溫反應(yīng).標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物.洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì).

　　3) 加酶標(biāo)抗體,保溫反應(yīng).固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合.洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體.此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢抗原的量相關(guān).

　　4) 加底物顯色.固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物.通過(guò)比色,測(cè)知標(biāo)本中抗原的量.在臨床檢驗(yàn)中,此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法.如抗體的來(lái)源為抗血清,包被和酶標(biāo)用的抗體最好分別取自不同種屬的動(dòng)物.如應(yīng)用單克隆抗體,一般選擇兩個(gè)針對(duì)抗原上不同決定簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物.這種雙位點(diǎn)夾心法具有很高的特異性,而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng),作一步檢測(cè).

　　在一步法測(cè)定中,當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí),過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合,而不再形成"夾心復(fù)合物".類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后帶現(xiàn)象,此時(shí)反應(yīng)后顯色的吸光值(位于抗原過(guò)剩帶上)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(位于抗體過(guò)剩帶上)某一抗原濃度的吸光值相同(參見(jiàn)1.3.2,圖1-4),如按常法測(cè)讀,所得結(jié)果將低于實(shí)際的含量,這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應(yīng)(hook effect),因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線到達(dá)高峰后呈鉤狀彎落.鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí),反應(yīng)甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果.因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)時(shí),應(yīng)注意可測(cè)范圍的最高值.用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng).

　　雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子(RF)的干擾.RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合.用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有RF,它可充當(dāng)抗原成份,同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合,表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng).采用F(ab')或Fab片段作酶結(jié)合物的試劑,由于去除了Fc段,從而消除RF的干擾.雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響,已被列為這類試劑的一項(xiàng)考核指標(biāo)(參見(jiàn)6.2).

　　雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原,但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原,因其不能形成兩位點(diǎn)夾心.

　　2.2 雙抗原夾心法測(cè)抗體

　　反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似.用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測(cè)相應(yīng)的抗體.與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體.此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,可直接用于測(cè)定,因此其敏感度相對(duì)高于間接法.乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法.本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,尋找合適的標(biāo)記方法.

　　2.3 間接法測(cè)抗體

　　間接法是檢測(cè)抗體常用的方法.其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗體)以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法(見(jiàn)圖2-3).操作步驟如下:

　　1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原.洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì).2)加稀釋的受檢血清,保溫反應(yīng).血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物.經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去.

　　3)加酶標(biāo)抗抗體.可用酶標(biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體,但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗體.固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合,從而間接地標(biāo)記上酶.洗滌后,固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān).

　　4)加底物顯色本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷.間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法.間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度.雖然有時(shí)用粗提抗原包被也能取得實(shí)際有效的結(jié)果,但應(yīng)盡可能予以純化,以提高試驗(yàn)的特異性.特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì),例如以E.Coli為工程酶的重組抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能與受過(guò)E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng).抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì),例如來(lái)自人血漿或人體組織的抗原,如不將其中的Ig去除,試驗(yàn)中也發(fā)生假陽(yáng)性反應(yīng).另外如抗原中含有無(wú)關(guān)蛋白,也會(huì)因竟?fàn)幬蕉绊懓恍Ч?

　　間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性.病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分.IgG的吸附性很強(qiáng),非特異IgG可直接吸附到固相載體上,有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面.因此在間接法中,抗原包被后一般用無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)(例如牛血清蛋白)再包被一次,以封閉(blocking)固相上的空余間隙.另外,在檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本須先行稀釋(1:40~1:200),以避免過(guò)高的陰性本底影響結(jié)果的判斷.

　　2.4 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體

　　當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去,或不易得到足夠的純化抗原時(shí),可用此法檢測(cè)特異性抗體.其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合.標(biāo)本中抗體量越多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少,因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng).如抗原為高純度的,可直接包被固相.如抗原中會(huì)有干擾物質(zhì),直接包被不易成功,可采用捕獲包被法,即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體,然后加入抗原,形成固相抗原.洗滌除去抗原中的雜質(zhì),然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng).競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體有多種模式,可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,抗HBc ELISA一般采用此法.另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,洗滌后再加入酶標(biāo)抗體,與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng).抗HBe的檢測(cè)一般采用此法.

　　2.5 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原

　　小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn),因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定,可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式.其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合.標(biāo)本中抗原量含量愈多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,最后的顯色也愈淺.小分子激素,藥物等ELISA測(cè)定多用此法.

　　2.6 捕獲包被法測(cè)抗體

　　IgM抗體的檢測(cè)用于傳染病的早期診斷中.間接法ELISA一般僅適用于檢測(cè)總抗體或IgG抗體.如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體,因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體,后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上.因此如用抗人IgM作為二抗,間接測(cè)定IgM抗體,必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理,以除去IgG的干擾.在臨床檢驗(yàn)中測(cè)定抗體IgM時(shí)多采用捕獲包被法.先用抗人IgM抗體包被固相,以捕獲血清標(biāo)本中的IgM(其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM).然后加入抗原,此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合.繼而加酶標(biāo)記針對(duì)抗原的特異性抗體.再與底物作用,呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān).此法常用于病毒性感染的早期診斷.甲型肝炎病毒(HAV)抗體的檢測(cè)模式見(jiàn)圖2-7.類風(fēng)濕因子(RF)同樣能干擾捕獲包被法測(cè)定IgM抗體,導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng).因此中和IgG的間接法近來(lái)頗受青睞,用這類試劑檢測(cè)抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功.

　　2.7 ABS-ELISA法

　　ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語(yǔ).親和素是一種糖蛋白,分子量60000,每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成.生物素為小分子化合物,分子量244.用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類型的大小分子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物,標(biāo)記方法頗為簡(jiǎn)便.生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性,其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多,兩者一經(jīng)結(jié)合就極為穩(wěn)定.由于一個(gè)親和素可與4個(gè)生物素分子結(jié)合,因此如把ABS與ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素(LA法和橋聯(lián)親和素-生物素(ABC)法兩種類型.兩者均以生物素標(biāo)記的抗體(或抗原)代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體(抗原).在LAB中,固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng),然后再加酶標(biāo)記的生物素以進(jìn)一步提高敏感度.在早期,親和素從蛋清中提取,這種卵親和素為堿性糖蛋白,與聚苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng),用于ELISA中可使本底增高.從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無(wú)此缺點(diǎn),在ELISA應(yīng)用中有替代前者的趨勢(shì).由于ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑,增加了操作步驟,在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA應(yīng)用不多.

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